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| 本發明提供了一種可同時篩選鎮痛中藥活性成分和確定其結合的阿片受體亞型的細胞膜色譜法，該方法包括如下步驟：白芷醇提液指紋圖譜的建立；輸精管平滑肌細胞的原代培養及傳代培養；效應成分的結合與解離；高效液相色譜測定結合前后圖譜變化。通過使中藥作用于不同種屬輸精管平滑肌細胞，考查其解離液在高效液相色譜柱上的行為，并用阿片受體激動劑和阿片受體拮抗劑作參比，即可考查該中藥活性成分與某種阿片受體亞型的親和力。以輸精管上的阿片受體作為鎮痛藥作用關鍵環節的篩選模型，除可對具有鎮痛作用的中藥進行活性成分篩選外，還可直接確定該活性成分與某種阿片受體亞型有親和力，具有良好的應用前景。 |
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一種篩選鎮痛中藥活性成分的細胞膜色譜法
一種篩選鎮痛中藥活性成分的細胞膜色譜法，其特征在于包括如下步驟： （１）白芷醇提液指紋圖譜的建立：稱取２０ｇ白芷藥材，加入１６０ｍｌ９５％乙醇，回流提取１～２ｈ，揮干乙醇，殘渣用甲醇溶解定容至２０ｍｌ，從中取２５０μｌ用甲醇稀釋至７．５ｍｌ，過０．４５μｍ微孔濾膜，得到濾液即為白芷醇提液；吸取濾液２０μｌ，采用高效液相色譜方法進行測定，得到白芷醇提液有效成分群指紋圖譜，確定１３個共有指紋峰； 所述高效液相色譜分析條件：以甲醇－水為流動相系統，柱溫３０℃，進樣量２０μｌ，波長２５４ｎｍ，長度為２５０ｍｍ、直徑為４．６ｍｍ的Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ５－Ｃ１８色譜柱，流動相梯度：０～５ｍｉｎ，５％～２０％甲醇；５～１５ｍｉｎ，２０％甲醇；１５～２０ｍｉｎ，２０％～７０％甲醇；２０～３０ｍｉｎ，７０％甲醇；３０～４０ｍｉｎ，７０％～９０％甲醇；上述均為體積百分比； 所述白芷醇提液指紋圖譜的１３個共有指紋峰各相對保留時間分別為： １號峰：０．０３１～０．０３４；２號峰：０．０８６～０．０８８；３號峰：０．６０７～０．６４９； ４號峰：０．６５８～０．６６５；５號峰：０．７０４～０．７０８；６號峰：０．７３０～０．７３９； ７號峰：０．７４９～０．７５５；８號峰：０．８１０～０．８１６；９號峰：０．８４２～０．８４７； １０號峰：０．８５６～０．８６１；１１號峰：１；１２號峰：１．０８５～１．０８７； １３號峰：１．１８１～１．１８６； 各共有指紋峰相對峰面積范圍分別為： １號峰：０．００５～０．０６１；２號峰：０．０１６～０．１３２；３號峰：０．０５０～０．３６６； ４號峰：０．０１０～０．１３５；５號峰：０．０３～０．１４８；６號峰：０．００６～０．１５３； ７號峰：０．０８６～０．３２８；８號峰：０．０４７～０．１０５；９號峰：０．０１８～０．０５９； １０號峰：０．０３０～０．１１３；１１號峰：１；１２號峰：０．２５１～０．４９２； １３號峰：０．３０４～０．８４５； 以上均以１１號峰為參照； （２）輸精管平滑肌細胞的原代培養及傳代培養：取成年雄性小鼠或成年雄性兔的輸精管，剝離內外膜組織，采取酶消化法在培養瓶中培養細胞；當細胞長滿覆蓋瓶底面積８０％左右時，進行傳代； （３）效應成分的結合與解離：將經３～１０代傳代的細胞消化得到的細胞懸液與步驟（１）獲得的白芷醇提液等體積混合均勻，３６～３８℃溫育０．５～２４ｈ后，離心去上清，用ＤＭＥＭ培養液洗滌細胞３～５次，得到均勻懸液，離心，棄上清液，得沉淀細胞；在沉淀細胞中加入ｐＨ２～６的ＰＢＳ使細胞變性，離心，收集上清液并揮干，得解離物； （４）高效液相色譜測定結合前后圖譜變化：將步驟（３）所得解離物用甲醇溶解，用高效液相色譜分析，所述高效液相色譜分析條件與步驟（１）的色譜分析條件相同；通過比較解離物指紋圖譜和白芷醇提液指紋圖譜中各吸收峰的變化，并分別用阿片受體拮抗劑和阿片受體激動劑作參比，確定白芷是否與阿片受體結合；與阿片受體特異結合的特征峰為７號峰、８號峰和１０號峰；篩選出的白芷鎮痛活性成分為７號峰、８號峰和１０號峰；所述阿片受體拮抗劑為鹽酸納洛酮，所述阿片受體激動劑為鹽酸哌替啶。
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| 專利號: |
200810027521 |
| 申請日: |
2008年4月18日 |
| 公開/公告日: |
2008年10月15日 |
| 授權公告日: |
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| 申請人/專利權人: |
暨南大學 |
| 國家/省市: |
廣州(81) |
| 郵編: |
510632 |
| 發明/設計人: |
聶紅、尹震 |
| 代理人: |
裘暉 陳燕嫻 |
| 專利代理機構: |
(44245) |
| 專利代理機構地址: |
() |
| 專利類型: |
發明 |
| 公開號: |
101285799 |
| 公告日: |
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| 授權日: |
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| 公告號: |
000000000 |
| 優先權: |
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| 審批歷史: |
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| 附圖數: |
3 |
| 頁數: |
9 |
| 權利要求項數: |
2 |
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